Tes Jurnal Praktikum Mikrobiolgi Jilid VI (Penghitungan Jumlah Mikroba Dengan Ruang Hitung)

TES JURNAL 6

PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DENGAN RUANG HITUNG

 (Sumber :http://www.samyakinternational.com)

1.        Apakah tujuan percobaan kali ini ?

-      Mahasiswa mampu melakukan pengamatan mikroba pada alat hemasitometer dengan bantuan mikroskop.

-      Mahasiswa mampu melakukan perhitungan jumlah mikroba dengan menggunakan ruang hitung.

2.        Apa yang Anda ketahui mengenai perhitungan jumlah bakteri ?

Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak langsung) Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara langsung. Penghitungan mikroba secara langsung antara lain:

1.      Plate Count (hitungan cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.

2.      Turbidimetri

Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm – 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).

3.      Hemasitometer

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

3.        Apa yang Anda ketahui mengenai Hemasitometer ?

Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles Malassez.

Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki persegi-persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1 mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm³=25.10^-5 mm³.

Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi kontaminasi.(id.wikipedia.org)

Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-Improved.

4.        Apa saja kelemahan dan kelebihan dari metode perhitungan bakteri secara langsung ?

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:

·         Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.

·         Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung.  Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.

·         Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal untuk bakteri 10⁶ sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung

·         Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam perhitungan sel.

Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.

5.        Bagaiman cara menghitung sel mikroorganisme dengan ruang hitung ?

Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian supaya tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu :

·         Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.

·         Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang diamati/dihitung.

6.        Bagaiman metode perhitungan untuk percobaan kali ini ?

Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm² terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm², dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer  digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitung sebagai berikut:

Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak

Jumlah sel per mm³ sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar  ×  (1/0,02)

Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm³ sampel × 10³

                                                     = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak× (1/0.02)x 10^3 

Jumlah sel per ml sampel =  Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak × 50 × 10³

Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel per ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 10⁶ = 1,5 × 10⁷.

7.        Apa tujuan dilakukannya scrub pada NA miring yang berisi biakan dan tujuan penggunaan air steril ?

·      Hal ini dimaksudkan agar spora Aspergillus niger dapat lepas dan tersuspensi dalam air steril.

·      Penggunaaan air steril untuk membuat suspensi spora dimaksudkan agar tidak terdapat mikrooba lain yang terlarut dalam suspensi. Tersuspensinya spora dalam air steril ditandai dengan berubahnya warna air steril dari jernih menjadi keruh.

8.        Apa tujuan dilakukannya pembersihan hemasitometer menggunakan alkohol

Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan hemasitometer dan cover glass dengan menggunakan alkohol. Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan.

9.        Mengapa setelah membilas, hemasitometer tidak boleh dilap dengan menggunakan tisu biasa ?

Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu lensa. Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan hemasitometer. Hal ini bertujuan agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak hilang.

10.    Setelah dilakukan 2 hal di atas, apa lagi yang harus dilakukan sebelum pengamatan ?

Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan mikroba.

11.    Berpakah besar pengamatan yang digunakan untuk pengamatan pada hemasitometer ?

400 kali

12.    Apa sebenarnya tujuan dilakukan pengenceran ?

Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan penghitungan dapat diminimalkan.

13.    Langkah Kerja !

a.    Dituangkan air steril sebanyak 5 mL pada media agar miring yang telah ditumbuhi koloni Aspergilus niger hingga seluruh bagian media agar miring yang ditumbuhi koloni terbasahi.

b.    Digaruk (scrubbing) koloni Aspergilus niger pada media agar miring yang telah terbasahi dengan menggunakan kawat ose hingga air steril dalam tabung terlihat keruh.

c.    Dibersihkan permukaan ruang hitung (hemasitometer) dengan secarik kertas lensa yang telah dibasahi dengan setetes air suling. Dibersihkan juga kaca tutup ruang hitung sampai tidak lagi tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya.

d.   Diambil suspensi Aspergilus niger secukupnya dengan menggunakan pipet tetes dan diletakkan pada tepi kaca tutup, maka dengan sendirinya tetesan tersebut akan mengalir ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang hitung.

e.    Ditutup ruang hitung dengan kaca penutup dan diletakkan di atas pentas mikroskop dengan hati-hati

f.     Diamati jumlah sel kapang dengan obyektif 400 kali.

g.    Dilakukan perhitungan jumlah sel kapang dalam 5 persegi besar (80 persegi kecil) sebanyak dua kali (duplo), yaitu pada bagian atas dan bawah hemasitometer. Jika jumlah sel kapang dalam 1 persegi kecil > 10 sel dan dalam 1 persegi besar  > 100 sel, maka suspensi kapang perlu diencerkan.

h.    Pengenceran 1:10 dilakukan dengan cara 1 mL suspensi Aspergilus niger diambil dengan menggunakan pipet ukur 1 mL dan diletakkan pada labu takar 10 mL. Kemudian, ditambahkan air steril hingga batas labu takar dan digoyang hingga suspensi kapang homogen.

i.      Langkah 4 sampai 7 diulangi.

j.      Dihitung jumlah rata-rata sel kapang dari dua kali perhitungan tersebut.

versi document bisa didapatkan disini...

DOWNLOAD

BACA JUGA ARTIKEL INI : HEMASITOMETER
                             TIPE-TIPE HEMASITOMETER